PLS - IN PRESENZA
N. 8 STUDENTI
Studio della regolazione da piccoli RNA non-codificanti
Dal: 9/6/2025 - Al: 13/6/2025 - Durata: 15 ore
Farmacia e Biotecnologie - FaBiT
In presenza.: esperienza suddivisa in turni di mezza giornata
(Lun-Mer); 1h Gio; 2h Ven
Labs Didattici FaBiT, via della Beverara 123; Bologna
La regolazione genica è il modo in cui le cellule controllano la quantità e il momento dell'espressione di specifici geni. Questo processo è importante per diverse attività cellulari e per le risposte ai cambiamenti dell'ambiente. Un attore chiave in questa regolazione sono i piccoli RNA non-codificanti (ncRNAs, sRNAs, etc): brevi filamenti di RNA che aiutano a controllare l'espressione genica in molti tipi di organismi. Nei batteri, gli sRNAs possono cambiare rapidamente come i geni vengono espressi, permettendo alle cellule di adattarsi a nuove condizioni. Nei batteri come Escherichia coli, gli sRNAs lavorano tipicamente legandosi all'RNA messaggero (mRNA), che porta le istruzioni dal DNA per produrre proteine. Questo legame avviene spesso in regioni specifiche dell'mRNA, permettendo agli sRNAs di interferire con il processo di traduzione o di influenzare la stabilità dell'mRNA.
Lo scopo di questa esperienza è di ricapitolare la regolazione post-trascrizionale dell'mRNA sodB di E. coli da parte del sRNA RyhB in vivo.
A questo scopo, la regione bersaglio di RyhB, è stata clonata in fusione con una sequenza che codifica per la proteina GFP, che conferisce una fluorescenza verde alle cellule di E. coli. Per dimostrare che RyhB regola direttamente l'espressione di sodB, la sequenza bersaglio di sodB sarà soggetta a mutagenesi sito-specifica per interrompere l’appaiamento tra il sRNAs e il suo bersaglio. L’ipotesi di regolazione diretta potrà essere accettata se i cloni mutagenizzati perdono la capacità di essere regolati da RyhB, rendendo l'espressione di GFP, e quindi la fluorescenza dei batteri, non reattiva al variare della concentrazione intracellulare di RyhB, repressa da ferro.
Mutagenesi sito-specifica, Elettroforesi preparativa su gel, Purificazione del DNA, Ligazione, Clonaggio molecolare, Fusioni di geni reporter GFP, Fluorimetria, Analisi dei dati